接种对罐体进行降温，冷却到30℃左右；接种；在进样孔旁围上一圈脱脂棉，倒上酒精，点火对加样孔进行灭菌，灭菌后，由 进样孔进行接种。开始发酵设置参数，温度设置在37℃，打开循环水路的阀门，水龙头关小，开始发酵；取样；没两小时取样一次，取样前要相对管道进行灭菌，打开取样器的阀门，打开蒸 汽进口阀，对管道灭菌15min，在冷却5min后方可取样，每次取样前都要对管道进行灭菌。

1.灭菌前： 室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母发酵）用6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵pH很长时间是碱性的（如某些细菌发酵）用6.86校正零点，9.18校正斜率）； 室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定，100%点接上溶氧电极，放置在空气中较定；或2.0点在灭菌过程中，温度达到121度左右压力0.12mpa左右时候标定，100%在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定，转速在发酵初始转速，通气量在发酵初始通气量时候标定 灭菌： 1.灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80~90℃，将排气阀逐渐关小。接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。

2.保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。（注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。） 灭菌后: A.消耗甘油阶段 1.灭菌后冷却30℃时：2.冷却至30℃时，开启搅拌(转速****)和通气(0.1-1.0vvm),接通28%氨水(未稀释)调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐； 3.从摇瓶中接种种子液，DO值为100%，开始培养后会消耗，导致DO值下降，通氧气以确保DO值超过20％，速率先为0.1vvm。4.发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。

3.每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析 5.这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。重组蛋白质不产生。 B.甘油补料阶段1.将12ml/LPTM1加入50%VVM的甘油中，将补料速率设为18.15ml每小时每升初试发酵液体积。 2.甘油补料将进行约4h或更长。在本阶段完成后细胞产量应达到180-220g/L湿细胞，但是不会有重组蛋白质的产生。 4％甘油的是所建议的在补料中的****水平，更高的甘油浓度将会产生毒害问题。